A doença de Pyle é uma doença esquelética rara dos ossos longos apresentando metáfise ampla, trabecularização aumentada, afinamento cortical e aumento do risco de fraturas por fragilidade causada por mutações de perda de função de Sfrp4, do inglês Secreted Frizzled Receptor Protein 4. Em camundongos com deleção de Sfrp4 (Sfrp4-/-), o afinamento cortical ocorre pela diminuição da remodelação do periósteo e endósteo, principalmente devido à ativação da via de sinalização não-canônica Wnt. Sfrp4 é um inibidor da via Wnt que se liga diretamente aos ligantes Wnt, interferindo em sua capacidade de interagirem com seus receptores e, assim, bloqueando as vias canônica e não-canônica. A proteína da matriz extracelular Agrin, que está envolvida em vários processos biológicos, tem importante contribuição na diferenciação osteoblástica modulando a via de sinalização Wnt, sugerindo possível envolvimento da expressão de Agrin e Sfrp4 na osteogênese mediada pela via Wnt. Além disso, os pacientes com doença de Pyle apresentam manifestações dentárias, incluindo dentes cariados e mal posicionados, taurodontismo, dentes decíduos retidos, erupção tardia dos dentes permanentes, prognatismo mandibular e má oclusão dentária de Classe III. Considerando que o desenvolvimento dentário é regulado por interações entre o epitélio dentário e o mesênquima através de uma complexa rede de sinalização, vários estudos demonstraram que alterações na via Wnt levam a diversas anomalias dentárias, como dentes dismórficos, ausentes e supranumerários. Essas manifestações dentárias observadas nos pacientes com doença de Pyle sugerem um potencial envolvimento de Sfrp4 no desenvolvimento e mineralização dos dentes e na suscetibilidade à cárie dentária. Dessa forma, estabelecemos as hipóteses que Agrin e Sfrp4 estão envolvidos na diferenciação osteoblástica mediada pela via Wnt, e que Sfrp4, pela sua interferência na via Wnt, regula as interações celulares entre epitélio e mesênquima e é necessário para o desenvolvimento dentário.Portanto, os objetivos deste estudo são: 1) investigar a expressão de Agrin em células-tronco mesenquimais da medula óssea e da polpa dentária de camundongos Sfrp4-/- na diferenciação osteoblástica e em odontoblastos, respectivamente e 2) explorar o efeito da deleção de Sfrp4 nas células da polpa dental e no desenvolvimento dentário. Os resultados desse estudo poderão gerar dados importantes sobre o efeito da ativação simultânea das vias canônica e não-canônica da Wnt, e da associação entre as expressões de Sfrp4 e Agrin na osteogênese e odontogênese, e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para pacientes com doença de Pyle. (AU)

Dentre as principais doenças cardiovasculares está o infarto do miocárdio (MI). Após o MI, uma parte do tecido miocárdico não tem eficiência para regeneração em novo tecido cardíaco funcional. Em vez disso, é formado na área infartada uma cicatriz. A extensão da cicatriz formada determina a tendência à remodelação cardíaca adversa e o mau funcionamento cardíaco. Dada a capacidade limitada de auto renovação, estratégias baseadas em células para regenerar os cardiomiócitos perdidos ou para promover o reparo endógeno tornou-se importante, e busca de terapias de engenharia de tecido para o tratamento do IM passaram a ser pesquisadas. Nesse contexto, células estromais mesenquimais (MSC) cultivadas in vitro, principalmente a partir de tecido adiposo cardíaco e Human Wharton's jelly-derived (células do cordão umbilical), têm sido estudadas. As vesículas extracelulares (EV) são fatores ativos secretados pelas MSCs, que desempenham papel na sinalização parácrina e na comunicação célula a célula. No entanto, seu mecanismo de ação, as vias de sinalização ativadas e a via de administração ideal para permitir que a dose EV seja localmente suficiente para os efeitos benéficos permanecem desconhecidos. Nesse sentido, este estudo tem como objetivo isolar o EV de MSC derivadas de Human Wharton's jelly-derived (WJ) sob Boas Práticas de produção (GMP) e avaliar seus efeitos anti-inflamatórios in vitro. Além disso, produzir scaffolds cardíacos com MSC-EV, implantar em modelo suíno de IM, avaliar a função cardíaca e mortalidade. Métodos: A produção e o isolamento das vesículas extracelulares de WJ- MSC serão realizados em condições de GMP. As análises de transcriptômica e proteômica serão realizadas para distinguir as moléculas funcionais contidas nas EV. Os níveis de citocinas circulantes serão medidos nos sobrenadantes de cultura de células por ELISA. Os scaffolds pericárdicos descelularizados serão obtidos no BST's Tissue Bank. Os scaffolds serão enriquecidos com EV com 20 ou 40 milhões de MSC, WJ misturados em um hidrogel de peptídeo de grau GMP. Os scaffolds de pericárdio enriquecido com MSC, WJ-EV serão implantados em suínos com IM. Quarenta animais serão divididos em quatro grupos: MI + sem implantação scaffold (n = 10), MI + implantação scaffold (n = 10), MI + scaffold com baixa dose EV (n = 10) e MI + scaffold de alta dose EV (n = 10). A função cardíaca será avaliada por ressonância magnética. Os animais serão sacrificados 1 mês após a indução do IM. Os tecidos serão coletados para análises em estudos futuros. Os dados gerais serão analisados estatisticamente com a análise estatística mais adequada correspondente de acordo com o tipo de dado e distribuição de normalidade. O nível de significância será definido em 5%. (AU)

A análise da citoxicidade de novos fármacos, compostos e biomateriais em cultura celular (monocamda em 2-dimensões) é uma alternativa interessante para reduzir a utilização de animais, que por sua vez recebem controles cada vez mais rígidos. Entretanto, esta técnica não mimetizada de forma real um tecido e/ou órgão. Órgãos em chip são dispositivos que imitam tecidos e órgãos do corpo. Neste estudo será desenvolvido um dispositivo microfluídico de baixo custo empregando as técnicas de xurografia e poliéster-toner empregando o hidrogel metacrilato de gelatina (GelMA), pois mimetiza a matrix extracelular (ECM), sendo adequado para cultura celular. Além disso, o GelMA permite a montagem organizadas de várias linhagens celulares. O objetivo principal é desenvolver e padronizar o dispositivo, e após isso, avaliar a segurança dos extratos vegetais de barbatimão (Stryphnodendron sp) e guaçatonga (Casearia sylvestris) e das membranas de latex reforçadas com estes extratos e frações nestes dispositivos. Além disso, o biodevice de látex de seringueira com células tronco mesenquimais (CTMs), objeto de estudo do Auxílio Temático FAPESP 2016/01743-5 será avaliado nestes órgãos em chip. Espera-se que está técnica que mimetiza tecidos e/ou orgãos compreenda as interações e o mecanismos existentes de uma forma mais real. (AU)

O câncer da mama é uma doença de alta prevalência e incidência. As alterações nos padrões de metilação do DNA estão relacionados com a promoção e desenvolvimento do câncer da mama. Os padrões de metilação em elementos da via de apoptose estão associadas à progressão, sobrevivência e metástases da doença. A identificação de alterações de metilação induzida por drogas específicas em células de câncer de mama, particularmente nas populações de células-tronco tumorais (CTT), em associação com células mesenquimais é desconhecido. O objetivo do presente estudo é pesquisar a metilação de genes associados a apoptose, avaliar marcadores na progressão da doença e o significado biológico de diferentes padrões de metilação. Para isso, vamos realizar cultura celular de células de câncer de mama com perfil invasivo e não invasivo e com a co-cultura com células-tronco mesenquimais, avaliar as modificações na viabilidade, apoptose e expressão modificações genes relacionados com apoptose após a exposição as drogas 5-aza-dC e TSA. A colaboração deste projeto com o Laboratório Irma H. Russo, MD, Breast Cancer Research (BCRL) a Fox Chase Cancer Center - Temple University Health System, dirigido por José Russo, irá fornecer ferramentas de última geração e intercâmbio de científico que nos permitirá descrever as vias moleculares que influenciam nos efeitos epigenéticos induzidos por tratamentos com drogas na reversão de propriedades tumorigênicas. A atual proposta é um complemento para o projeto "Interação de células tronco mesenquimais com células da linhagem de câncer de mama e avaliação do seu comportamento biológico", FAPESP número de concessão 13/04659-7. (AU)

Os fibroblastos são mediadores da fibrose renal e de outros órgãos mas a sua origem durante a fibrose ainda não está completamente elucidada. Fibroblastos ativados surgem de células epiteliais residentes através da transição epitélio mesenquimal (EMT) ou direto da medula óssea. Nós estamos estudamos uma terceira origem dos fibroblastos na fibrose renal: a transição endotélio mesenquimal (EndMT). Além disso, as vias de sinalização envolvidas no recrutamento e na diferenciação ainda não estão completamente elucidado. Recentemente, a via de sinalização Notch ganhou interesse devido à sua influência na comunicação intercelular durante a organização celular, coordenando o crescimento dos vasos sanguíneos. De fato, alterações sutis na atividade de Notch são suficientes para causar diferenças no comportamento de formação do endotélio e nos vasos sanguíneos. Portanto, a hipótese de que a sinalização Notch é crucial para EndMT. Nesse projeto, pretendemos avaliar a contribuição da via de sinalização Notch na EndMT, e finalmente, a sua contribuição para o desenvolvimento da fibrose renal em um modelo de zebrafish de doença renal crônica, tendo como vantagem do modelo e a possibilidade de visualizar o processo in vivo. Para corroborar está estratégia, também será estabelecido um modelo murinho de doença renal crônica para estudar a via Notch. Linhagem endotelial em zebrafish utilizado com pTol-cdh5 Notch-RFP para rastreio da expressão de Nocth1 e nos camundongos Cdh5creNotch1lox/lox-GFP serão submetido a lesão renal e utilizaremos para confirmar a presença de EndMT na fibrose renal. Nós iremos utilizar diferentes estratégias de imagem, de inibição farmacológica e biologia celular/molecular para demostrar a presença e a função da via Notch na EndMT. EndMT pode contribuir para acumulação de fibroblastos e miofibroblastos na fibrose renal e qualquer tentativa de descobrir novos mecanismos ativados poderá ser implicado no potencial terapêutico.

Apesar dos recentes avanços, as doenças cardiovasculares (DCV) permanecem a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, reduzindo a qualidade de vida de pacientes. A disfunção endotelial é uma característica central na patofisiologia de diversas doenças cardiovasculares e se manifesta em pacientes com fatores de risco cardiovascular como aterosclerose, hipertensão e diabetes mellitus. Por esta razão, o endotélio representa um alvo poderoso no desenvolvimento de novos tratamentos para as doenças cardiovasculares. Células-tronco mesênquimais (CTMs) têm sido utilizadas para aplicações terapêuticas. As CTMs são células multipotentes, capazes de se diferenciar em vários tipos celulares, exercendo efeito antiproliferativo, imunomodulador e anti-inflamatório. Um tipo de célula com as quais as CTMs podem interagir durante o processo de reparo cardiovascular é a célula endotelial (CE). Aqui, nós levantamos a hipótese de que a interação entre CTMs transplantadas e CEs pode reparar a disfunção endotelial através da modulação a atividade da óxido nítrico sintase endotelial eNOS regulando a produção de óxido nítrico (NO) e/ou restaurar a permeabilidade vascular e o processo inflamatório endotelial.

Apesar dos recentes avanços terapêuticos no controle e prevenção das doenças cardiovasculares (DCVs), o infarto do miocárdio e a insuficiência cardíaca ainda permanecem como grande desafio para saúde mundial. De fato, apesar de descobertas bem sucedidas, os pesquisadores buscam novos tratamentos que possam ser usados em conjunto para a recuperação da função cardíaca. O estresse oxidativo resulta em acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) e contribui para a patogênese de diversas doenças cardiovasculares, como hipertensão, aterosclerose, hipertrofia cardíaca, insuficiência cardíaca e diabetes mellitus. Nos últimos anos, estudos com células-tronco elevaram as expectativas dos pesquisadores, pacientes e médicos no tratamento das DCVs. Células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido utilizadas por possuírem potenciais aplicações terapêuticas. CTMs contribuem para a reparação dos tecidos in vivo e são consideradas uma alternativa atraente às células-tronco embrionárias na engenharia de tecidos e medicina regenerativa. CTMs podem facilmente serem obtidas a partir da medula óssea adulta e não apresentam problemas éticos como fonte de células-tronco multipotentes capazes de se diferenciar em linhagens de células mesodérmicas. Os efeitos das CTMs no estresse oxidativo ainda são desconhecidos. Dados recentes do Laboratório do Prof. Hare demonstram que camundongos deficientes para GSNOR (S-nitrosoglutathione reductase) tem proteção das proteínas cardíacas contra ROS. Em nosso projeto proposto, utilizando o mesmo modelo animal, iremos determinar se a administração transendocárdica de CTMs alogênicas irá reduzir ainda mais o estresse oxidativo em camundongos GSNOR-/- comparados aos seus controles C57BL6/J durante a remodelação ventricular esquerda. Além disso, avaliaremos se as CTMs restauram o estado redox em cardiomiócitos, e em células endoteliais e reduzem possíveis danos causados pelo superóxido. Para testar esta hipótese, propomos os seguintes objetivos específicos: 1. Testar se as CTMs alogênicas diminuem o estresse oxidativo in vivo no miocárdio dos animais durante o remodelamento ventricular esquerdo (pós-injúria) reduzindo a produção de ROS. Existem evidências de que as células-tronco mesenquimais são seguras e eficazes no tratamento de transtornos caracterizados pelo remodelamento do ventrículo esquerdo (VE). Nossa hipótese é de que as CTMs podem restaurar o equilíbrio redox perdido durante a remodelação do VE. Portanto, vamos avaliar os mecanismos moleculares pelos quais as CTMs controlam a produção de superóxido e peróxido de hidrogênio, bem como biomarcadores de danos do estresse oxidativo. Para caracterizar o papel de CTMs na produção de superóxido e peróxido de hidrogênio no miocárdio, vamos utilizar sondas específicas descritas em nossa seção de métodos. Esta metodologia será a mesma que utilizamos em nosso projeto desenvolvido no Brasil. 2. Testar a hipótese de que CTMs alogênicas restauram o estado redox in vitro, em cardiomiócitos e células endoteliais, e reduzem a produção de ROS/dano oxidativo. CTMs são uma promissora terapia celular na reparação cardiovascular. Nosso estudo irá avaliar a capacidade destas células em reduzir o estresse oxidativo em cardiomiócitos e células endoteliais. Vamos testar se co-cultura de CTM e células endoteliais ou cardiomiócitos -expostas aos macrófagos resultam na preservação e reparação da interação célula-célula, biodisponibilidade de NO e sobrevivência celular. Juntos, estes resultados podem sugerir/direcionar aos possíveis mecanismos envolvidos na quebra do insulto oxidativo/nitrosativo.

A exposição acidental e ocupacional à radiação ionizante (IR) pode induzir danos celulares em diversos organismos vivos em doses subletais. A energia depositada nas células induz a quebra de ligações químicas, danificando tanto estruturas básicas como o DNA, resultando em uma gama de lesões dentre as quais as quebras duplas de DNA (DSB) desempenham papel fundamental na determinação da sobrevivência celular frente à exposição a IR. As células possuem vários mecanismos para reparar o dano ao DNA, mas uma vez que ele não seja corretamente reparado ou na ausência de reparo, aberrações cromossômicas, perda de material genético e morte celular podem ocorrer como um efeito direto. Uma consequência das aberrações cromossômicas é a formação de micronúcleos (MN), resultado da fixação incorreta dos cromossomos aos fusos mitóticos no processo de segregação na anáfase. Células de mamíferos possuem mecanismos para reparar as DSB e prevenir os rearranjos cromossômicos, os quais envolvem uma série de moléculas, como as histonas H2AX. Sua ativação é um dos primeiros eventos nas células após a exposição a agentes danosos aos DNA. A fosforilação da H2AX ocorre na cromatina ao redor da DSB, onde centenas de moléculas de ³-H2AX se aglomeram induzindo a abertura da estrutura da cromatina, ou servindo de plataforma para o acúmulo de outros fatores envolvidos na resposta ao dano do DNA.A indução de dano ao DNA não é uma característica exclusiva de células irradiadas. Células ao redor das que foram diretamente expostas à IR podem exibir comportamento similar: elas morrem ou apresentam instabilidade cromossômica ou outras anormalidades. Este fenômeno é chamado de efeito do expectador. Estudos in vitro apontam duas principais vias envolvidas no efeito do expectador induzido pela radiação (RIBE): junções comunicantes e os fatores solúveis secretados pelas células. In vivo as respostas indiretas das células à IR são referidas como efeito abscopal, no qual o sistema imune parece desempenhar papel chave na indução da morte do tumor ou sua regressão, enquanto a instabilidade genômica, morte celular e transformação oncogênica de tecidos normais podem ocorrer em paralelo, constituindo um problema ainda sem solução. O conhecimento mais aprofundado dos mecanismos que envolvem o RIBE permitirão o desenvolvimento de estratégias mais apropriadas para o combate aos tumores e/ou à proteção de células de tecidos normais dos danos consequentes da exposição à IR. Considerando esta problemática, o objetivo deste trabalho é avaliar o dano ao DNA relacionado ao RIBE nas células-tronco mesenquimais (MSC), utilizando as seguintes estratégias: análise da formação de MN e quantificação de moléculas ³-H2AX. Para tanto, será utilizada a linhagem de células imortalizadas de embriões de camundongos C3H10T1/2. Para o sistema bystander, as MSC serão cultivadas em insertos (1 ¼m) e transferidas para poços contendo MSC irradiadas, imediatamente após a irradiação. A irradiação será realizada em aparelho de raio-X convencional (250 kVp), com uma taxa de dose de 300cGy/min, em doses únicas variando de 0,5 a 6 Gy. O dano cromossômico será avaliado pela técnica padrão para MN com bloqueio de citocinese utilizando citoclasina B; ao menos 500 células binucleadas em 10 diferentes campos serão examinadas em microscópio de fluorescência. Além disso os MN serão avaliados por citometria de fluxo utilizando um kit comercial (In Vitro MicroFlow®); a validação desta técnica para as MSC é vantajosa uma vez que análises baseadas na seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) permitem a coleta de múltiplos parâmetros simultaneamente, dando pistas sobre o modo de ação genotóxico (clastogenicidade ou aneugicidade). O dano ao DNA também será avaliado por citometria de fluxo, dado pela média da intensidade de fluorescência de ³ -H2AX. Coletivamente, estes ensaios contribuem significativamente na avaliação do RIBE nas MSC devido à especificidade destes na análise do dano ao DNA. (AU)

Defeitos ósseos assumem importância na crescente prevalência de condições crônicas de saúde visto que fraturas e defeitos críticos deverão aumentar conforme o envelhecimento da população. O reparo ósseo depende de uma densa rede vascular que fornece oxigênio e nutrientes essenciais, sendo esta uma característica importante para o processo de regeneração do tecido. Os tratamentos convencionais necessitam de transplantes e abordagens extremamente invasivas, representando assim um desafio o desenvolvimento de novos tratamentos. Uma proposta promissora é a obtenção de tecidos complexos em laboratórios utilizando scaffolds para o crescimento e diferenciação de células-tronco mesenquimais e inclusão de fatores proteicos que permitam apropriada neovascularização e osteoindução para enxertia. Este projeto objetiva investigar o efeito do grafeno nas propriedades biológicas e mecânicas do polímero-base para os scaffolds (policaprolactona) e a produção de scaffolds 3D bioativas por meio da incorporação de hidroxiapatita (HA) e fosfato tricálcico (TCP) para aumentar o reconhecimento biológico e recrutamento de células para colonizar os scaffolds e consequentemente melhorar o processo de regeneração óssea. Além disso, scaffolds 3D bioativos serão revestidos com proteína morfogenética óssea humana, como hBMP-2 e proteínas P-1 do látex da seringueira Hevea brasiliensis, na tentativa de melhorar a bioatividade, adesão, proliferação e diferenciação das células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs). A fração proteica F1 do látex natural da seringueira contem importante atividade angiogênica e cicatrizante, vantagens estas promissoras para utilização na engenharia de tecidos somadas às propriedades e multipotencialidade das hMSCs nos scaffolds. (AU)

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma ferramenta promissora para o tratamento de uma variedade de lesões e doenças devido à sua secreção de numerosas moléculas bioativas que levam à regeneração tecidual. O sistema nervoso central (SNC) tem uma capacidade limitada de regeneração. Sendo assim, as CTMs estão sendo avaliadas para terapia celular para diversas condições neurológicas degenerativas e inflamatórias crônicas. A Mieloencefalite Equina por Protozoário (EPM) e a Mielopatia Estenótica Vertebral Cervical (CVSM) são doenças neurológicas comuns em equinos onde a terapia convencional padrão frequentemente não resulta em recuperação funcional completa. Os objetivos deste projeto são compreender melhor a neurodiferenciação e função das CTMs no contexto do líquido cefalorraquidiano (LCR) normal e inflamado, e determinar se a administração intratecal de CTMs alogênicas é segura em cavalos saudáveis. Este projeto possui duas partes. Para a parte in vitro (parte 1), LCR de cavalos normais (n = 5) e de cavalos com EPM e CVSM (n = 5) serão utilizados. O LCR será avaliado para constituintes celulares e proteicos. Além disso, será avaliada a resposta à co-incubação de CTMs da medula óssea (MO) com LCR durante 5 dias, através da análise das CTMs para viabilidade, proliferação, capacidade imunomoduladora e liberação de fatores neurotróficos. Adicionalmente, será avaliado qual fonte mostra a melhor capacidade de neurodiferenciação in vitro (MO, n = 3; tecido adiposo (TA), n = 3 ou do cordão umbilical (CU), n = 3). Para a segunda parte do estudo, será avaliada a viabilidade e segurança do transplante intratecal alogênico de CTMs em cavalos saudáveis (n = 6). CTMs-MO alogênicas serão utilizadas para a inoculação. Os cavalos serão injetados via lombo-sacra (LS, n = 3) e atlanto-occipital (AO, n = 3) com 100x106 MSCs. Para um subconjunto destes cavalos, as CTMs serão radiomarcadas com tecnécio antes da injeção via LS (n = 1) e AO (n = 1). Cintigrafia será realizada nestes dois cavalos em 0, 1, 6, e 24 horas após a injeção. Amostras de sangue e LCR serão coletados antes e após a injeção de CTMs (dia 0 e dia 30). Exames clínicos neurológicos completos serão realizados duas vezes por semana por 30 dias após a administração das CTMs. Este estudo pode ajudar a compreender os mecanismos pelos quais as CTMs trabalham em doenças do SNC. Além disso, se a administração das CTMs for bem tolerada nos cavalos saudáveis, estes dados podem apresentar uma justificativa fundamental para a administração de CTMs em cavalos que se apresentam com sequelas neurológicas secundárias a EPM e CVSM mal-responsivas ao tratamento convencional. (AU)